单细胞分选到底有多难?
来源:    发布时间: 2018-02-26 09:10   303 次浏览   大小:  16px  14px  12px
众所周知传

众所周知传统的生物学分析方法常见的研究对象就属群体细胞了,可这么一来使得细胞之间的生物学差异可能会相互掩盖,生物信息容易消失在大背景中。源于基因随机表达的细胞异质性,导致很难解释细胞和细胞之间的在转录和翻译水平的差异[1],所以在单细胞层面研究基因组学、表观基因组学和转录组学就显得尤为重要了。
       
以单细胞测序应用为例,想在单个细胞水平上进行测序,首先就需要将它们从群体细胞中分离出来,那么单细胞的精准分离则是后续完成准确测序的前提,2015 年发表在《Molecular Cell》杂志上的一篇 Review[2] 就提到几种单细胞分选方法,详见下表:
 
 
由上可看出利用流式细胞分选技术进行的单细胞分选,具有精度高、通量大、分选参数多,成本相对低等优点。但要通过流式分选出足够多的符合要求的单细胞进行下游实验并没有那么容易。下面三方面是务必要考虑的问题:
  • 活性
细胞活性状态对后续实验而言非常重要,就拿转录组分析为例,无论是 RNA-Seq 还是高通量表达谱芯片技术,都需要高质量的 RNA 样本,细胞活性不好或死细胞会直接导致 RNA 降解,实验无法继续。
  • 精度
流式分选是精密度超高的仪器,稍稍不同的参数(激光、液流等)的设置都会直接造成结果偏差;另外既然是想研究单细胞,那么就得确保分选得到的确为单个细胞,否则同样没有意义。
  • 效率
自动化替代人工无疑是提高效率、节省成本的有力举措;当你需要分选超低含量的细胞时,务必是个长时间工程,鞘液用光时,其更换繁琐度、耗时、连续性等都是需要考虑的。
 
Bio-Rad 公司提供的 S3eTM 流式细胞分选仪能够简单快速分选出单细胞,实现高活性、高精度、高效率,为下游多组学研究奠定基础。
 
高活性:
 
 
高精度:
 
 
高效率:
 
 
回到今天主题——单细胞分选,下面我们来看看 Bio-Rad S3eTM 神器是如何进行单细胞分选的,其结果又如何?带着这个问题,咱往下看~
 
材料和方法
 
1. 准备分选用的 Jurkat 细胞和微球
Jurkat 细胞用含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基培养,每 2~3 天传代以确保活性。分选前,细胞用分选溶液(含 3% FBS 的 PBS)洗 2 遍

2. 细胞计数
用 TC20TM(Bio-Rad, #1450102)自动细胞计数仪计数,将细胞终浓度调整至 2*106/ml,平均分到两个 5 ml 管子中

3. 细胞处理
① 空白 Control 细胞,不染色,用 40 um 的过滤器过滤后上流式分选仪,调节合适电压,找到正确的设门位置;
② 目标细胞用 1*CytoTrackTM Green 511/525 Dye(Bio-Rad,  #1351203)室温避光染色 15 min,1 000 g 离心 5 min,弃上清,用 3 ml 分选溶液洗涤一遍,再次离心,将细胞重悬于 1 ml 新鲜的分选溶液里,最后用 40 um 的过滤器过滤后上流式分选仪。微球分选实验,取 15 um 微球(Thermo Fisher #F13838)30 ul 加到 500 ul PBS。

分选设置
       
S3eTM 细胞分选仪配置蓝(488 nm)和红(640 nm)两根激光,采用 ProLineTM 校准微球,通过监测废液流中微球信号以计算液滴延迟,确保高度的准确性和精确度。调节分选角度确保分选细胞落入 8 联排平底管的中央。
 
单细胞分选及荧光成像确认

在 8 联排收集平底管每孔的中央加入 1 ul 矿物油(Sigma, #M3516),少量的矿物油可以将分选下来的细胞或微球维持在一个有限的区域里,便于观察和确认单细胞(注:此方法不推荐用于其他分选应用)。为了避免样本蒸发,分选完成后加上盖子,最后用 ZOETM 荧光成像仪(Bio-Rad, #1450031)观察,用明场和绿色荧光通道观察细胞,用明场观察微球。

结果
       
优化偏转角度对于分选精度是至关重要的。偏转角度确保了分选细胞能够落入 8 联排平底培养管孔的正中央位置,从而也提高了回收率。左右两边的电荷以 1% 幅度调节调至最佳偏转角度(如图 1),且左右两边的分选精度是一致的。
 

图 1. 偏转角度优化
       
分选单个细胞的精度用染 CytoTrackTM Green 511/525 Jurkat 的细胞来验证,分选单个微球的精度用 15 um 的聚苯乙烯微球来确定,用 ZOETM 来观察的结果见图 2。细胞和微球分到了 13 个 8 联排中,共 104 个孔。其中 98 个孔含单个细胞,其余孔没有荧光或仅细胞碎片,精度达到 94%(98/104);微球有 104 个孔全部是单个的,精度达到 100%。
 
 

 
图 2. 用 ZOETM 荧光成像仪验证单个细胞和单个微球。
单个 Jurkat 细胞(A)和单个微球(B),BF: brightfield;G: green fluorescence;M: merged

答案找到了吗?Bio-Rad S3eTM 分选仪在此次实验中的表现是 94% 的单细胞分选精度,100% 的微球精度,感觉棒棒的,还真想拿样本去亲自体验一下~(提醒:文末有彩蛋)
 

 
最后 Bio-Rad 建立了一个简单的工作流程(图 3)来说明 S3eTM 细胞分选仪分选单个细胞到 8 联排平底培养管中,并用 ZOETM 荧光成像仪来验证单个细胞分选的精度。
 
图 3. S3eTM 单细胞分选工作流程
   
彩 蛋
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联系方式>>
电话: 4008203630 或 8008205567 邮箱:sales.china@bio-rad.com
 
参考文献:
[1] Raj A and van Oudenaarden A (2008). Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell 135, 216-226.
[2] Yong Wang and Nicholas E. Navin (2015). Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies. Molecular Cell 58.
图片及数据来源:
Bio-Rad Bulletin 6853