利用 NGC 柱串联 Tandem 和自动上样器实现单克隆抗体自动化纯化
来源:    发布时间: 2018-01-12 12:03   438 次浏览   大小:  16px  14px  12px
Olivier Dalmas,1

Olivier Dalmas,1 Chelsea Pratt,2 Jie Tang1
1NGM Biopharmaceuticals, 333 Oyster Point Blvd, South San Francisco, CA 94080
2Bio-Rad Laboratories, Inc., 6000 James Watson Drive, Hercules, CA 94547

 
➤ 摘 要
 
单克隆抗体(mAbs)已经成为了一类非常重要的高效生物治疗药物。为了获得理想的特异性和优秀的结合动力学的单克隆抗体,往往需要纯化数百个候选单抗并进行下游的筛选检测。我们将介绍一个高度可靠和可重复的自动化单克隆纯化筛选方法。这种方法在两天内可以实现 84 个样品高纯度毫克级别产品的纯化。使用这种方法我们纯化了约 500 个单抗候选药物,极大的突破了单抗筛选的瓶颈。

 
➤ 背 景 介 绍
 
单克隆mAbs目前广泛的用于临床治疗, 包括多种癌症、多发性硬化症和类风湿性关节炎等等。开发一种治疗用单抗药物通常需要筛选和纯化数百个候选单抗药物。下游的检测和表征一般需要毫克级别以上的高纯度蛋白, 并且这些蛋白需要保存在合适的缓冲液中。例如低pH值的溶液会导致样品的单抗样品的降解。细胞的功能检测需要特殊的盐浓度和 pH值。这些苛刻的要求都成为了单抗纯化的瓶颈。为了增加现有单抗纯化流程的
 
通量,我们整合 NGC Discover Pro 层析系统和 Teledyne CETAC ASX-560 自动上样器。NGC Discover Pro 系统的多维层析功能可以实现整个纯化流程的自动化操作,ASX-560 自动上样器可以实现最多 84 个 50 ml 锥形管的自动化上样。NGC 数据通信模块(SIM)用于两个设备之间数据通信。我们通过这个系统,在两天的时间内完成了 84 个样品自动化的纯化,并且获得了高纯度的产品。
 
 
➤ 材 料 和 方 法

NGC 系统配置
 
NGC 系统型号:Discover Pro System。添加柱串联模块,共包含系统泵,双溶液进口阀门,混合阀,上样阀,样品泵,样品选择阀,两个柱切换阀,多波长检测器,出口阀,pH 模块。溶液进口阀连接有实验用溶液和清洗液。出口阀用于收集穿透组分(flowthrough),收集器 BioFrac Fraction Collector 用于有效组分收集。
 
NGC 系统和 CETAC 自动上样器连接
 
Teledyne CETAC ASX-560 自动上样器使用 0.8 mm 样品针,将该管线连接到 NGC Discover Pro 系统的 0.75 mm PEEK 进液阀管线。两个设备的数据通信使用 NGC SIM 数据通讯盒。连接 CETAC 自动进样器到 SIM 的 aux. 端口,NGC 系统就可以发送样品装载信号给自动上样器,控制其上样。
 

图1 CETAC ASX-560 自动上样器和 NGC 系统整合. A, NGC 系统和 ASX-560 自动上样器通过 NGC SIM 可以被同一台电脑控制. B, NGC SIM 和 ASX-560 自动上样器的Aux. I/O 连接.
 
CETAC AScript 软件
 
ASX-560 自动上器控制软件是 AScript,可以编辑逐行命令来进行步进控制(图 2)。以下是 AScript script 和 NGC 连接的上样程序脚本。
 
Step 1: Define Label
Step 2: Wait (Time)
Step 3: Wait for Port Input
Step 4: Move to Next Tube
Step 5: Lower Sample Probe
Step 6: Wait (Time)
Step 7: Wait for Port Input
Step 8: Move to Rinse
Step 9: Wait (Time)
Step 10: Pump Off
Step 11: If Position… Go to Label
 
第一次信号输入(Step 3)是 NGC 给出开始信号,允许设备进行平衡,降低样品针,装载样品。第二个信号输入(Step 7)时 NGC 给出关闭信号,允许上样器结束装载并且清洗上样针。最后一步(Step 11),循环整个脚本,进行多样品的自动化上样。这个脚本用于 ASX-560 自动上样器的多样品无交叉污染的自动化上样。
 

图2 ASX-560 自动上样器和 NGC 系统连接在 AScript 软件上脚本
 
纯化实验
 
A 1 ml HiTrap MabSelect SuRe 亲和柱用于单抗捕获阶段,使用 HBS 清洗液清洗(50 mM HEPES,pH 7.5,150 mM NaCl)和 0.1 M 乙酸洗脱(50 mM acetate pH 3.5,150 mM NaCl)。柱串联步骤使用根 5 ml HiTrap Desalting 脱盐柱用于脱盐中和洗脱后的样品所有层析柱在两个次上样之间使用三倍柱体积的 0.5 M NaOH 清洗,并使用 HBS 平衡。
 
SDS-PAGE 电泳检测
 
纯化收收集的单抗组分使用 TGX Stain-Free 预制胶分离,使用 Gel Doc EZ 成像系统成像检测。
 
液质联用检测(LC-MS
 
纯化后抗体使用 Agilent 1200 HPLC 液相系统和 Agilent Q-TOF 6520 质谱进行分析。Poroshell 300SB-C8 用于脱盐和分离。
 
 
➤ 结 果
 
通量和回收率的提高
 
单克隆抗体通过 Protein A 捕获,之后使用脱盐柱进行中和。利用 NGC Discover Pro 系统的多维层析功能,这些柱子可以自动化的进行平衡和清洗。在最大样品装载流速下, ASX-560 自动上样器可以在不到两天的时间内完成 84,但是样品的损失达到上扬量的 30%(图 3)。在低流速装载模式下,两天内可以完成 70 个样品的装载,但是样品的损失率降低到 6%(Figure 3)。
 
两种模式都可以获得毫克级的样品,足够下游的相关实验。
 

图3 通量和回收率的关系. 最大流速上样模式,两天完成 84 个样品,样品损失大约 30%。 低流速上样模式,2 ml/min,样品损失 6%。
Recovered protein ( ◆ ); samples/48 hours ( ■ );
ASX-560 Autosampler maximum sample capacity (—— ).
 
样品纯度和交叉污染
 
该方法生产蛋白量在 2~6 mg之间,产品纯度 >95%,SDS-PAGE 检测(图 4A)。为了保证柱串联自动化进行而不引人样品间的污染,我们选取三个纯化后的样品进行 LC-MS 分析, 并没有发现这些样品间有交叉污染(图 4B),证明该方法适合药物开发。
 

图 4 纯度和交叉污染检测. 纯化获得的单抗电泳样品纯度分析 (A) LC-MS 分析交叉污染 (B).
 
pH 和溶液的重复性
 
下游的细胞功能检测需要单抗存在的溶液有严格一致的 pH 和盐浓度。 在对比了八个使用自动化纯化平台纯化获得的样品的溶液的组成和洗脱图谱后,结果显示了溶液的离子强度和 pH 的高度的重复性。证明该方法适合后期的功能研究。(图 5
 

图 5 高度重复性. 对比八个单抗的纯化结果,在洗脱时间,终溶液的盐浓度和 pH 上变化微小。 A280 (—); 电导 (—); pH (—).
 
NGC System/ASX-560 整合实现自动化上样
 
系统可以轻松的配置成多维层析系统(Bio-Rad bulletin 6674)NGC 系统软件 ChromLab 内置柱串联和多维层析模板。
 
使用NGC 层析系统和自动上样器的整合,可以实现完全无人值守的治疗用单抗样品纯化,整个实验只需要进行三步人工操作: (1) 预冲洗上样管线 (2) 在软件 ChromLab 中输入纯化样品的数量 (3) 在 Ascript 方法中输入运行次数。该套自动化系统已经完成了约 500 个。
 
 
➤ 结 论
 
通过NGC Discover Pro 结合 ASX-560 自动上样器, 我们构建了一个可靠强大的全自动纯化平台。每个样品运行需要 30~45 分钟,一个周末的时间就能完成 84 个样品的纯化。这套系统目前用于 NGM Biopharmaceutical 公司,极大的加速了他们治疗用单抗的开发流程。这一方法也很容易扩展到更加复杂工艺的自动化纯化,例如,3 维层析、4 维层析的纯化。