​热点追踪 | 厉害了,我的微滴数字 PCR
来源:    发布时间: 2017-12-19 17:31   323 次浏览   大小:  16px  14px  12px
基于伯乐 QX20

基于伯乐 QX200™ ddPCR 技术的单细胞 mRNA 和蛋白质同时绝对定量,将转录和翻译在单细胞水平上联系起来,为深入理解分子生物学中心法则提供了新的视角。

转录和翻译是分子生物学中心法则中基因表达的两个基本过程。细胞的克隆群体可能存在高度异质性,即同样的基因在不同的细胞个体中具有不同的 mRNA 和蛋白拷贝数。这种基因表达上的变异会导致不同的表型,影响诸多细胞的功能,包括发育、体内稳态、疾病过程。要想了解这种基因差异表达的原因和结果,需要在单细胞水平对 mRNA 和蛋白进行准确定量。微滴式数字 PCR 技术(ddPCR)的出现,为科学家们提供了简单可行的手段,无需繁琐的遗传学操作,易于重复和推广。
 
在单细胞水平计数 mRNA 的拷贝数已应用于很多研究,而在单细胞水平计数蛋白质分子的数量则相当具有挑战性。现有的各种技术需要繁琐的遗传操作或复杂的实验设备,而且往往只能获得蛋白质的相对丰度。为了解决这个问题,瑞士的科学家将 ddPCR 技术与邻近连接测试(proximity ligation assay, PLA)技术相结合(Digital-PLA),并建立的数学模型,实现对单个哺乳动物细胞中的 CD147 蛋白拷贝数的绝对定量。
 

图 1. ddPCR-PLA 实验流程 单细胞中 mRNA&蛋白质的同时定量

PLA 技术通过两个与 DNA 探针偶联的抗体(或核酸适体)对靶标蛋白进行特异性检测。当两个抗体结合到同一个靶标蛋白上,抗体上的两条 DNA 探针空间上彼此接近,连接子寡聚核苷酸与探针序列互补形成双链 DNA 后即可通过 PCR 方法检出。若结合 ddPCR 技术还能实现对靶标蛋白的绝对定量。该方法的检测下限(LoD)达到 10,000 个蛋白/细胞,能对中高丰度的蛋白进行定量。

研究人员将单个哺乳动物细胞的裂解物分成 2 份,分别用于蛋白和 mRNA 的定量。通过对 131 个人 HEK293T 细胞的分析,研究人员发现 CD147 mRNA 含量与蛋白质翻译水平之间仅有很弱的相关性,提示在单个 HEK293T 细胞中,CD147 转录水平未必能反应同期的翻译水平。
 
 
图 2. 131 个 HEK293T 单细胞中 CD147 mRNA 和蛋白的拷贝数

真核生物或原核生物中都能观察到单细胞中 mRNA 和蛋白含量的瞬时相关性很低的情况,这种弱相关性可能源自 mRNA 和蛋白质半衰期的差异,亦或是转录后调控因素导致不同细胞间每个 mRNA 分子翻译的蛋白质数量的差异。

动态基因调控在各种细胞调控系统中广泛存在,随着研究的深入,单细胞分析技术和方法获得越来越多的重视和发展。基于 QX200™微滴式数字 PCR 的 ddPCR-PLA 技术提供了特有的 mRNA 和蛋白质的绝对定量能力,且流程简单,易于推广。籍此科学家们能对单个细胞中基因的转录和翻译拍摄「数字快照」,通过数字化定量勾勒出基因表达调控网络,更加深入解析基因调控的本质和基本原理。

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